第一章 抗原抗体反应

抗体能特异地识别抗原并与之结合，这种特性是免疫学检测方法建立的基础。抗原与抗体之间的结合力主要包括静电引力、范德华引力、氢键和疏水作用力。多种因素影响抗原抗体反应。抗原抗体结合反应具有特异性、可逆性、比例性和阶段性等特点。本章主要介绍抗原抗体反应原理和抗原抗体结合反应的特异性、可逆性和比例性。

●1.1抗原抗体反应的基本原理

本节主要讲授抗原抗体反应的基本原理和抗原抗体反应影响因素。抗原与抗体结合除了空间构象互补外，抗原表位与抗体独特型必须紧密接触，才可能使基团之间有足够接近的距离以形成多种非共价键，形成足够大的结合力。液相中抗原抗体由亲水胶体转化为疏水胶体并进一步形成可见的抗原抗体复合物。

●1.2抗原抗体反应的特点

本节主要讲授抗原抗体结合反应的特异性、可逆性、比例性特点。特异性是指抗原抗体结合反应的专一性，是由抗原表位与抗体高变区的互补结合所决定的；可逆性是指抗原与抗体的结合在一定的条件下可解离为游离抗原与抗体；比例性是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系。

第二章抗体制备

临床常用的免疫学检测技术是基于抗原与抗体的特异性反应进行疾病诊断和治疗，人工制备抗体是大量获得抗体的有效途径，所以本章内容是该门课程的重点内容。如何获得特异性好、效价高的抗体则是影响诊断特异性与敏感性和治疗效果的关键。抗体制备技术发展经历了三个阶段：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体。本章从抗原的概念、特性、特异性及制备方面入手，介绍多克隆抗体的制备和单克隆抗体的制备流程及要点，并结合破伤风抗毒素的介绍，了解多克隆抗体的临床应用。

●2.1抗原的概念和特性

讲授抗原的概念及抗原的特性。抗原通常是指能与T、B细胞表面抗原受体结合，使其活化、增殖、分化产生效应T细胞或抗体，并与之特异性结合介导产生免疫效应的物质。抗原具有免疫原性和免疫反应性，只具有免疫反应性而无免疫原性的物质称为半抗原；半抗原与蛋白质载体结合后可获得免疫原性成为完全抗原。

●2.2抗原的特异性

讲授抗原的特异性。决定抗原特异性的物质基础是抗原表位，抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。来源不同、但含有相同或相似抗原表位的抗原称为共同抗原；将某种抗原刺激机体产生的抗体与具有相同或相似抗原表位的其他抗原发生的反应称为交叉反应。

●2.3多克隆抗体制备

本节内容以蛇毒患者的治疗为切入点，突出抗血清即多克隆抗体在临床应用中的重要性。内容包括多克隆抗体的概念、免疫原的制备和多克隆抗体的制备流程和要点。

●2.4破伤风抗毒素

本节主要讲授破伤风抗毒素的来源、用途、临床应用及注意事项。以破伤风为例，讲解疾病的病因、发病机制、临床表现、治疗以及预防等。重点强调由于破伤风抗毒素是动物来源的生物制品，临床应用要格外慎重。通过对本节内容的学习，帮助学生了解破伤风抗毒素，知道这种临床常用的生物制品的应用范围和注意事项。

●2.5单克隆抗体的制备

本节内容以多克隆抗体特异性不高，不利于临床应用为切入点，引出单克隆抗体的出现解决了这一缺陷。从单克隆抗体的概念、制备原理、制备流程三方面介绍，环环相扣，将前因后果清晰的表达出来。单克隆抗体的制备涉及的环节较多，内容较抽象，是学习的重点和难点内容。

●2.6HAT选择性培养的原理

本节内容是单克隆抗体的制备流程中杂交瘤细胞的筛选，是单抗制备的关键步骤，HAT选择性培养的原理也是单抗制备涉及的重要理论基础，内容较抽象，难理解，是学习的难点内容。

第三章常用的免疫测定技术

免疫测定是应用抗原-抗体反应原理，测定样本中待测物质的有无或其浓度高低的一类实验。免疫测定在生物、医学领域都有广泛应用，在临床医学领域的应用最为广泛。临床实验室中，免疫测定包含了所有以抗原、抗体为检测对象的测定试验，其检测结果可帮助临床医生对疾病进行诊断、治疗、监测以及预后评估等。免疫测定技术不断提高、进步和优化，从最初的放射免疫测定技术，到现在的酶免疫测定技术、化学发光免疫测定技术、免疫荧光测定技术，以及现在最新的免疫芯片技术、免疫传感器技术等。结合免疫测定技术的发展历程，在本章中着重从均相和非均相免疫测定分类角度介绍免疫测定技术，同时对免疫测定中涉及的方法类型加以阐述。

●3.1免疫测定技术的发展历程及分类

免疫测定的形式多种多样，但都是以抗原抗体间特异性结合反应为基础的。免疫学检验技术的发展大致分为经典、现代和自动化三个基本阶段，其中现代标记免疫测定技术应用最为广泛。在免疫测定时，根据信号检测前未结合标记物和结合标记物是否需要经过清洗、离心、过滤等步骤进行分离，可将免疫测定分为均相免疫测定和非均相免疫测定。

●3.2均相免疫测定

均相免疫测定是指在信号检测前无需对未结合标记物进行清洗和分离，反应中所用的标记物只有与待测物质或抗体结合后才能产生信号，存在于反应体系中的未结合标记物对测定结果不产生影响，所以无需对其进行清洗和分离。均相免疫测定只有一种液体相反应形式，主要是竞争性方法。主要检测技术有荧光偏振免疫测定、酶放大免疫试验技术、克隆酶供体免疫试验和发光氧通道免疫试验。

●3.3非均相免疫测定

非均相免疫测定又称为异相免疫测定，通常需要依赖于将抗原、抗体等反应物质包被于固相物质（如反应板、反应微孔或磁珠等）,经过洗涤步骤将未结合的标记抗原或抗体分离出反应体系，再通过各种不同的信号报告系统检查抗原抗体复合物的量。否则，无论待测物质的浓度高低，所产生的信号水平均相同。由于分离是免疫测定过程中至关重要的步骤，在免疫技术发展过程中，已经产生了很多种非均相分离技术。

●3.4标记免疫测定的方法类型

免疫测定技术用于样本中抗体或抗原的检测时，根据检测原理和目的的不同可分为四种基本的方法类型：夹心法、间接法、竞争法和捕获法，它们具有不同的方法学特点和应用。

第四章免疫测定标记物

标记免疫测定方法主要由抗原抗体特异结合反应和标记物示踪检测两部分组成。标记物是高灵敏免疫测定的物质基础，通常采用各种化学交联试剂将其与特异抗原或抗体共价交联，从而得到标记物-抗原或抗体结合物，是标记免疫测定试剂的核心组分。本章着重介绍酶免疫、化学发光免疫、荧光免疫和胶体金免疫测定标记物特点。

●4.1免疫测定标记物种类

临床免疫分析技术常用的标记物可分为放射性核素和非放射性核素两大类，后者包括荧光物质、酶、化学发光剂、胶体金、生物素和量子点等。

●4.2酶免疫测定标记物

酶催化的特点是效率高且专一性强，酶的信号放大作用十分强大，与每分子标记物的单一信号相比，灵敏度可增强百万倍。最初应用的酶主要是辣根过氧化物酶（HRP),其来源丰富，易于提取，标记相对简单。随着技术的进步，用于标记的酶已扩展到碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等二十多种酶，但应用最多的是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

●4.3化学发光免疫测定标记物

某些小分子化合物在常温下会发生化学反应（主要为氧化还原反应）,反应过程释放的能量使产物分子或反应中间态分子上升为激发态，当其再回到基态时，会发出光子，使化学能转变为光能。正是基于这一现象，并使其与特异性抗原-抗体反应相结合，在此基础上建立了化学发光免疫测定方法。根据标记物和发光机制不同，分为鲁米诺、异鲁米诺等环酰肼类化合物、吖啶类标记物和三联吡啶钌标记物等。

●4.4荧光免疫测定标记物

荧光免疫测定是指先用化学方法把荧光试剂共价偶联到抗体或抗原分子上，再通过免疫反应形成带有荧光标记的抗原抗体复合物。通过荧光检测仪器探测荧光信号，达到定性、定量和定位检测的目的。目前在免疫测定中用于标记抗原和抗体的荧光试剂主要有三类材料，分别为有机荧光染料、稀土荧光标记材料和无机荧光染料量子点。

●4.5胶体金免疫测定标记物

胶体金也称金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，故称胶体金。胶体金颗粒大小不同，呈色不同。胶体金属微粒已经广泛应用于电镜、免疫印迹、生物条形码、体外诊断试剂等领域，能对抗原或抗体进行定位、定性和定量分析。

第五章免疫凝集试验

免疫凝集试验是指颗粒性抗原或覆盖了可溶性抗原（或抗体）的致敏载体颗粒与相应抗体（或抗原）结合后，在适宜的电解质条件下出现肉眼可见的凝集现象。颗粒性抗原参与的反应为直接免疫凝集试验，可溶性抗原（或抗体）致敏的载体颗粒参与的反应为间接免疫凝集试验。根据载体不同有多种试验类型，常用的有协同免疫凝集试验、间接免疫血凝试验、胶乳颗粒凝集试验、明胶颗粒凝集试验、甲苯胺红颗粒凝集试验等。

●5.1免疫凝集试验基本原理

细菌、螺旋体或红细胞等颗粒性抗原在悬液中带负电荷，周围吸附一层与之牢固结合的正离子，外面排列了一层松散的负离子层，构成双层粒子云。在粒子云内界和外界之间的电位差形成Z电位，Z电位使得各颗粒相互排斥。当特异性抗体与相应抗原颗粒互补结合时，抗体的桥联作用克服了颗粒表面的Z电位而使颗粒聚集在一起。免疫凝集现象的发生分为抗原抗体特异性结合阶段和可见的凝集反应阶段。

●5.2直接凝集试验

细菌、螺旋体、红细胞等颗粒性抗原，在适当的反应条件下（如pH、电解质浓度、离子强度等）,可直接与相应抗体结合出现肉眼可见的凝集现象，此类试验称为直接凝集反应。凝集反应中的抗原称为凝集原,参与反应的抗体称为凝集素。直接凝集反应最常用的有玻片凝集试验和试管凝集试验两种。

●5.3间接凝集试验

将可溶性抗原（或抗体）预先吸附或偶联于与免疫无关、大小适当的颗粒性载体表面，使之成为抗原（或抗体）致敏颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，可出现肉眼可见特异性凝集现象，称为间接免疫凝集试验。根据用于致敏载体的是抗原还是抗体以及凝集试验的方式可分为正向间接凝集试验和反向间接凝集试验。

●5.4间接免疫凝集抑制试验

以已知抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体为诊断试剂，检测标本中是否存在和致敏抗原相同的抗原。先将标本与抗体试剂作用，然后加入致敏载体颗粒，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原作用而发生凝集。如标本中存在相同抗原，则先将抗体试剂结合，后续加入的致敏颗粒无相应抗体与之反应，凝集现象被抑制。

●5.5协同免疫凝集试验

协同凝集试验与间接免疫凝集试验的原理相似，但所用载体是细胞壁含有A蛋白（SPA)的金黄色葡萄球菌，SPA具有与IgG(IgG3除外）的Fc段结合的特性。当这种葡萄球菌与IgG抗体通过SPA连接，就成为抗体致敏的颗粒载体。此时抗体的Fab段暴露于葡萄球菌菌体表面，仍保持与相应抗原特异性结合的特性。如与相应抗原接触，即出现反向间接免疫凝集试验。该方法可用于毒素、细菌、病毒及各种可溶性抗原的快速检测。

●5.6间接免疫血凝试验

间接免疫血凝试验是以红细胞作为载体的间接免疫凝集试验。用已知抗原或抗体致敏红细胞，再与待检标本中相应的抗体或抗原在适当条件下发生反应，红细胞凝集则为阳性。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱。

●5.7颗粒免疫凝集试验

间接免疫凝集试验可使用不同的载体进行抗原或抗体致敏，如红细胞为载体的血凝反应、胶乳为载体的胶乳凝集反应、金黄色葡萄球菌为载体的协同凝集反应。
其它还有如明胶颗粒、碳颗粒、甲苯胺红等。

●5.8自身红细胞凝集试验

自身红细胞凝集试验与一般间接免疫血凝试验不同之处在于反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料是抗人O型红细胞的单克隆抗体，该抗体能与不论何种血型的红细胞结合，但不出现凝集现象。

●5.9抗球蛋白红细胞免疫凝集试验 ( Coombs试验）

抗球蛋白参与的红细胞免疫凝集试验是在间接免疫凝集试验的基础上进行改进的一种试验方法，又称为Coombs试验。这是检测抗红细胞不完全抗体的一种经典方法。所谓不完全抗体，多数是7S的IgG类抗体，能与相应抗原牢固地结合，但因其分子量较小，不能起到桥联作用，在一般条件下不能出现可见反应。用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，发挥桥联作用而使红细胞凝集。

●5.10梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验

梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）是一种间接免疫凝集试验，临床上常用于梅毒诊断。本节将从TPPA试验原理、操作步骤、结果判断和异常情况等方面加以阐述。

第六章免疫沉淀试验

免疫沉淀试验是指可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，在适当条件下出现的沉淀现象。早在1897年，Kraus发现霍乱弧菌、伤寒杆菌、鼠疫杆菌的培养液能与相应抗血清产生沉淀反应。1905年，Bechhold在凝胶介质中进行了免疫沉淀试验。1946年，Oudin在试管中将抗原溶液加在含有抗体的琼脂凝胶柱上进行扩散，用于免疫化学分析，建立了最早的凝胶内免疫沉淀试验。1953年，Grabar与Williams首先将电泳技术与凝胶内免疫沉淀试验相结合建立了免疫电泳技术，此技术既有沉淀反应的特性，又有电泳技术的快速、灵敏度高和分辨力强的特点。1965年，Mancini建立了单向免疫扩散技术，使定性免疫沉淀试验向定量化发展。20世纪70年代，免疫浊度测定的问世使免疫沉淀试验适应了现代快速、微量和自动化的要求，目前已成为临床快速定量检测的重要技术手段。

●6.1免疫沉淀试验

免疫沉淀试验的基本原理是将可溶性抗原与相应抗体置于温度、酸碱度适宜的一定电解质溶液中，两者按适当比例形成沉淀，产生浊度，或在琼脂等凝胶中形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环，并根据所形成的沉淀物计算待测抗原或抗体的含量。根据沉淀反应介质和检测方法的不同，沉淀反应可分为：液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。

●6.2絮状免疫沉淀试验

絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。此方法明显地受抗原抗体比例的影响，因而常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。絮状沉淀试验在操作上大致有三种类型：抗原稀释法、抗体稀释法和方阵滴定法（棋盘滴定法）。方阵滴定法同时将抗原和抗体进行系列稀释，可一次找出抗原抗体反应的最适比例。

●6.3免疫浊度测定

免疫浊度测定是利用抗原抗体结合后，在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于免疫沉淀试验，实现对各种液相介质中的微量抗原、抗体等进行定量测定。根据仪器测量方式的不同，免疫浊度测定可分为透射免疫比浊试验和散射免疫比浊试验两种。

●6.4凝胶内免疫沉淀试验

凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。试验中常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。据抗原与抗体反应的方式和特性，凝胶内沉淀试验又分为单向扩散试验和双向扩散试验。

●6.5凝胶免疫电泳试验

免疫电泳技术是电泳分析与免疫沉淀试验相结合的产物，是直流电场作用下的凝胶扩散试验，是将抗原-抗体反应的高度特异性与电泳技术的高分辨率及快速、微量等特性相结合的一种免疫化学技术。免疫电泳技术可分为对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等多项技术，并被广泛应用于科学研究和临床实验诊断分析。

第七章非均相免疫标记技术

非均相免疫测定又称为异相免疫测定，指在信号检测前需要先将未结合的标记物从反应体系中分离出来。否则，无论待测物质的浓度高低，所产生的信号水平均相同。非均相免疫测定通常需要依赖于将抗原、抗体等反应物质包被于固相物质（如反应板、反应微孔或磁珠等）,经过洗涤步骤将未结合的标记抗原或抗体分离出反应体系，再通过各种不同的信号报告系统检查抗原抗体复合物的量。非均相免疫标记技术包括放射免疫试验、荧光免疫试验、酶免疫试验、化学发光免疫试验和固相膜免疫试验等，是目前临床主流检测技术。

●7.1非均相免疫测定的分离技术

由于分离是免疫测定过程中至关重要的步骤，在免疫技术发展过程中，已经逐渐产生了很多种非均相分离技术。根据固相物质的不同，可分为管式、珠式、微粒子、磁性颗粒等不同形式的固相包被技术。

●7.2放射免疫试验

放射免疫试验以放射性核素为基本特征，用放射性核素标记抗原或抗体分子，通过测定放射性强度评估抗原-抗体反应的情况，从而实现对待测物质的定量（或定性）分析。放射免疫试验将放射性核素的高灵敏性与抗原-抗体间的高特异性结合于一体，具有较高的分析敏感性和分析特异性。放射免疫试验开创了体液微量物质定量分析的新纪元，并为建立酶免疫试验、化学发光免疫试验等方法奠定了理论和实践基础。放射免疫试验包括放射免疫分析和免疫放射分析两种模式。

●7.3酶免疫试验

酶免疫试验是以酶标记抗体（抗原）作为主要试剂，将酶高效催化反应的专一性和抗原-抗体反应的特异性相结合的免疫检测技术。临床上常用的固相酶免疫试验包括ELISA、ELISPOT、发光酶免疫试验等。主要以聚苯乙烯作为固相载体的ELISA广泛用于定性测定中，既可用于测定抗原，也可用于测定抗体，主要有夹心法、间接法、竞争法和捕获法四种基本类型。ELISPOT结合了细胞培养技术和ELISA技术，主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定。

●7.4荧光免疫试验

荧光免疫试验是以荧光物质标记抗体或抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术，具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现的免疫标记技术。目前，荧光免疫试验已经广泛应用于临床检验和科学研究中。常见试验有间接免疫荧光试验、时间分辨荧光免疫试验、荧光酶免疫试验等。

●7.5化学发光免疫测定

化学发光免疫试验是用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。化学发光免疫试验已成为临床实验室的重要常规免疫检验技术，常见试验有直接化学发光免疫试验、化学发光酶免疫试验、电化学发光免疫试验等。

●7.6固相膜免疫测定

固相膜免疫测定是在酶联免疫吸附试验、单克隆抗体技术、荧光免疫试验、胶体金免疫技术和固相膜的基础上发展起来的体外诊断技术，常用试验有免疫层析试验、免疫渗滤试验、斑点酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验等。

●7.7免疫测定常见问题

随着免疫测定技术的不断进步，新方法层出不穷，为推进临床诊断效能，发挥了越来越大的作用。但在免疫检测技术知识学习和工作中也会碰到各种不同的问题，影响对各种试验方法检测原理知识的理解。在本节中选取了定标、钩状效应、抗抗体（二抗）和常见内源性干扰因素四个话题进行探讨。

第八章均相免疫标记技术

均相免疫测定技术是指在免疫测定操作过程中，将各种有关试剂依次混合在一起，反应后即可直接读取、测定结果的一种免疫测定技术。均相免疫测定由于无需分离结合的和未结合的免疫复合物，故具有操作简快、重现性好等特点，还可实现全自动化检测。根据实现均相免疫测定的具体方法，可分为以固相颗粒（乳胶、细胞等）为载体的凝集反应，基于液相、凝胶等的沉淀反应，标记免疫中的均相免疫测定技术等。本章主要介绍标记免疫中的均相免疫测定技术，包括酶放大免疫试验技术、克隆酶供体免疫试验、荧光偏振免疫测定和光激化学发光免疫测定。

●8.1酶放大免疫试验技术

酶放大免疫测定技术（EMIT)也称酶增强免疫测定。测定原理是通过酶活性的改变来测定待测物含量，由于标记抗原与抗体结合后产生的空间位阻阻挡了酶与底物结合的部位，使得酶的活性受到抑制。反应中半抗原与酶结合，成为酶标记的半抗原，它同时保留了半抗原性和酶的活性。当此酶标半抗原与抗体结合，两者密切接触而使酶的活性中心受影响，从而抑制了酶的活性。

●8.2克隆酶供体免疫试验

克隆酶供体免疫测定（CEDIA)是利用重组DNA技术制备β-半乳糖苷酶的两个片段：称为酶受体（EA)的大片段和称为酶供体(ED)的小片段。两个片段本身均不具有酶的活性，但在合适的条件下结合在一起就具有了酶活性。当标记了酶供体的抗原与抗体结合后，由于空间位阻，阻止了酶供体（ED)与酶受体（EA)的结合，从而不能形成有活性的全酶，使酶的活性受到抑制，形成负反应曲线，从而实现定量检测。

●8.3荧光偏振免疫测定

荧光偏振免疫试验是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与荧光素抗原抗体复合物之间荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子抗原物质的含量。

●8.4光激化学发光免疫测定

发光氧通道免疫试验（LOCI)最初由Ullman等在1994年报道，是一种均相免疫检测技术，属于化学发光技术之一，国内更多称其为光激化学发光（LiCA)，因具备高灵敏度、高特异性、线性范围宽等优点而广泛应用于生物分子的检测。

第九章生物素-亲合素系统 (BAS)

生物素-亲合素系统（biotin-avidin system,BAS)是20世纪70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。具有桥联抗原抗体系统和示踪物指示系统的作用，广泛应用于各种标记免疫分析技术中。

●9.1生物素-亲合素系统

生物素与亲合素是一对具有高度亲合力的分子，其结合迅速、专一、稳定。它们既能偶联抗原、抗体、核酸等大分子生物活性物质，又能被酶、荧光素、胶体金、化学发光物及放射性核素等示踪物标记，具有桥联抗原抗体系统和示踪物指示系统的作用。BAS与示踪物的牢固结合及多级放大效应，极大地提高了免疫检测和分析的灵敏度。

●9.2生物素亲合素特点

生物素与亲合素是一对具有高度亲合力的分子，其结合迅速、专一、稳定。它们既能偶联抗原、抗体、核酸等大分子生物活性物质，又能被酶、荧光素、胶体金、化学发光物及放射性核素等示踪物标记，具有桥联抗原抗体系统和示踪物指示系统的作用。BAS与示踪物的牢固结合及多级放大效应，极大地提高了免疫检测和分析的灵敏度。

●9.3ABC-ELISA检测原理

生物素（biotin)又称维生素H或维生素B7，广泛分布于动物及植物组织。能与抗原、抗体大分子生物活性物质及酶等示踪物结合。亲合素（avidin)和链霉亲合素（streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物，1个亲合素或链霉亲合素可以结合4个生物素。几乎所有用于标记的物质均可以与亲合素或链霉亲合素结合，最常用于标记酶、荧光素及胶体金等示踪物。生物素-亲合素系统具有特异性高、敏感性高、稳定性高和适用性广特点。

●9.4生物素-亲合素系统在临床上应用

生物素与亲合素（或链霉亲合素）的结合具有亲合力高、特异性强、稳定性好和多级放大作用，以及两者均可以与各种生物活性分子及示踪物结合等优点，使生物素-亲合素系统广泛应用于各种标记免疫分析技术中，如酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫及固相膜免疫检测中的应用。在本节中结合临床具体检测项目，对其中生物素-亲合素的应用加以介绍。

第十章流式细胞技术

本章学习主要掌握流式细胞分析技术的基本原理、数据显示与分析及FSC、SSC和设门等概念、流式细胞术散点图的种类和设置方法；熟悉FCM分析中选用荧光染料的原则、荧光补偿和同型对照的的定义；了解流式细胞术在科研和临床中的主要应用包括哪些方面。
流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。流式细胞仪的基本结构包括液流系统、光学系统和电子系统。其工作原理液流系统将单个颗粒传输到光学系统检测，再通过光电倍增管将光信号转换成电信号，获得各种颗粒的参数。采用激光作为激发光源保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。
FCM广泛应用于免疫学基础研究和多个临床应用方面，包括细胞凋亡与周期的检测、淋巴细胞及其亚群分析、自身免疫病相关人类白细胞抗原分析、白血病免疫分型、肿瘤耐药相关蛋白分析和移植免疫中的应用等多种应用。

●10.1流式细胞分析技术

流式细胞仪的基本结构包括液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理与放大的计算机系统也叫电子系统三个部分组成。其工作原理：液流系统将单个颗粒传输到光学系统检测，再通过光电倍增管将光信号转换成电信号，电信号通过计算机系统转换，获得各种颗粒的参数。带分选系统的流式细胞仪还可以按实验设计要求分选出具有相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。

●10.2流式细胞技术数据显示与分析

流式细胞仪的参数主要包括前向散射光FSC, 侧向散射光SSc和荧光参数FL。前向散射光（FSC）大小能反映细胞形态和大小。侧向散射光（SSC）的大小和细胞内的颗粒度成正相关。数据显示方式主要包括单参数直方图、双参数散点图和多参数图。单参数直方图是由一维参数和颗粒计数构成。双参数散点图即是横纵坐标分别代表两个参数。在正式实验以前还要进行荧光补偿的调节。为了缩小分析细胞的范围，还需要利用设门技术选定要分析的特定细胞群。

●10.3流式细胞术在科研与临床中的应用

由于流式细胞术具有快速、准确和定量的特性，目前已广泛应用于医学基础研究和临床检测。主要包括以下几个分类。包括细胞凋亡与周期的检测、淋巴细胞及其亚群分析、自身免疫病相关人类白细胞抗原分析、白血病免疫分型、肿瘤耐药相关蛋白分析和移植免疫中的应用、血小板自身抗体检测、检测细胞内因子（TH1/TH2细胞检测）和PNH诊断等多种科研和临床应用。